Systematic interrogation of tumor-infiltrating lymphocytes is key to the development of immunotherapies and the prediction of their clinical responses in cancers. We performed deep single-cell RNA sequencing on 5,063 single T cells isolated from peripheral blood, tumor, and adjacent normal tissues from six hepatocellular carcinoma patients. The transcriptional profiles of these individual cells, coupled with assembled T cell receptor (TCR) sequences, enable us to identify 11 T cell subsets based on their molecular and functional properties and delineate their developmental trajectory. Specific subsets such as exhausted CD8⁺ T cells and Tregs are preferentially enriched and potentially clonally expanded in hepatocellular carcinoma (HCC), and we identified signature genes for each subset. One of the genes, layilin, is upregulated on activated CD8⁺ T cells and Tregs and represses the CD8⁺ T cell functions in vitro. This compendium of transcriptome data provides valuable insights and a rich resource for understanding the immune landscape in cancers.

Highlights

2017年6月16日，北大-清华生命科学联合中心，北京大学生命科学学院BIOPIC中心、北京未来基因诊断高精尖创新中心张泽民研究组，首都医科大学附属北京世纪坛医院暨北京大学第九临床医学院肝胆胰外科彭吉润研究组，及美国AMGEN公司的欧阳文军研究组在《Cell》杂志发表了题为“Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing” 的研究论文，首次在单细胞水平上描绘了肝癌微环境中的免疫图谱。

癌症免疫疗法是近年新兴的极具潜力的治疗方法，尤其是免疫检查点抑制剂疗法，如CTLA-4抗体Ipilimumab及PD-1抗体pembrolizumab目前都取得良好的疗效。虽然这种治疗方法可以达到显著的临床效果，但是在不同病人或者不同癌种之间的效果却很不均一。DNA变异的数目、肿瘤浸润淋巴细胞的水平以及药物靶点的表达等因素都会影响到各类肿瘤免疫治疗的效果。由于参与肿瘤发生发展的免疫细胞类型多样且异质性很强，只有开展单细胞水平的研究才能真正获得系统详尽的肿瘤免疫图谱，从而助力于肿瘤免疫疗法的发展及有效的靶点和生物标志物的发现。

中国肝癌发病率居世界之首，且术后存活率较低。之前的研究表明肝癌组织内富含大量肿瘤浸润淋巴细胞，但是相比于免疫疗法在黑色素瘤及肺癌等肿瘤上的成果，目前成功的针对肝癌的免疫治疗方法却鲜有报道。通过深刻了解肝癌的肿瘤免疫微环境来探索新的肿瘤免疫疗法及寻找新靶点和有效的生物标志物，对于肝癌的诊断和治疗具有重大意义。

张泽民研究组与彭吉润研究组及欧阳文军研究组深入合作，在单细胞水平对肝癌肿瘤微环境中T淋巴细胞的转录组及T细胞受体(TCR)序列进行了综合分析，完成了超过5000个T细胞的单细胞测序数据。基于生物信息学分析，通过对T细胞进行亚群分类、发展轨迹分析及比较不同亚群中T细胞克隆的分布，该研究探索了不同亚群之间的关系，鉴定每个亚群特异的基因表达，揭示了肿瘤中的T细胞在功能、分布和发展状态方面和其他部位的T细胞截然不同。肿瘤在免疫系统中出现逃逸的主要原因包括杀伤性CD8 T细胞的功能紊乱及抑制性T细胞的大量存在，针对这两类细胞寻找靶点是免疫疗法的主要方向。该研究着重探索了肿瘤中这两类细胞的特异表达基因，发现基因Layilin在这两群细胞中均特异性表达，并通过体外实验证明该基因对于CD8 T细胞的杀伤功能有抑制调节作用，可能作为一个免疫疗法的新靶点。同时，基于TCR数据分析，该研究发现肝癌内存在大量肿瘤组织特异的克隆增生的T细胞，但是这些细胞大多处于耗竭状态，从而揭示了肿瘤细胞逃逸免疫监视的原因。此外，该研究还描绘了初始T细胞向耗竭状态的发展轨迹，并在耗竭性CD8 T细胞亚群中发现了一类FOXP3+抑制性T细胞的存在，提出了耗竭T细胞会进一步发展成抑制性T细胞的潜在发展方向。

该项工作是国际上首次大规模针对肿瘤相关T细胞的单细胞组学研究，提供了极有价值的数据资源，为多角度理解肝癌相关的T细胞特征奠定了基础。该项工作的数据积累、科学发现和理论推演有望促进已有的免疫治疗方案在肝癌中的临床应用，并有助于发现有效的针对肝癌治疗免疫治疗靶点，进而加速创立新的肝癌免疫疗法。同时，该项工作也为肿瘤免疫的图谱勾画做出了范式，为今后其他肿瘤开展类似的研究及各类肿瘤免疫的发展提供基础。

北大-清华生命科学联合中心优秀博士后基金资助者，北京大学生命科学学院BIOPIC中心博士后郑春红，博士研究生张园园、郭心怡，前沿交叉研究院博士研究生郑良涛，北京大学医学部博士研究生郭化虎和美国AMGEN公司博士后Jae-Kwang Yoo为该论文的并列第一作者。北大-清华生命科学联合中心，北京大学生命科学学院BIOPIC中心、北京未来基因诊断高精尖创新中心张泽民，首都医科大学附属北京世纪坛医院暨北京大学第九临床医学院肝胆胰外科彭吉润，及美国AMGEN公司的欧阳文军为该论文的共同通讯作者。该项研究得到了北京未来基因诊断高精尖创新中心、国家重点研发计划、国家自然科学基金以及北大-清华生命科学联合中心的资助。